qpcr、WB內(nèi)參選取你選對了嗎

一、   何為內(nèi)參？

 有一類基因被稱為管家基因，其表達水平受環(huán)境因素影響較小，而且是在個體各個生長階段的大多數(shù)，或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。管家基因表達的蛋白質(zhì)就是我們WB實驗中所說的內(nèi)參。

 二、為何需要內(nèi)參？

 在Western blot實驗中，我們通常需要檢測不同處理條件下的蛋白質(zhì)含量變化，但由于實驗條件等因素的影響，不同樣品中蛋白質(zhì)總量可能會存在差異，因此需要使用內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化。使用內(nèi)參可以消除實驗條件等因素的影響，從而準(zhǔn)確地比較不同樣品中待檢測蛋白的含量變化。通俗地講，假設(shè)我們檢測到各組間目標(biāo)蛋白的信號強度明顯不同，可能是組間實際上就存在明顯表達差異（“真像”），也可能是由于我們加載的蛋白總量不同，或者蛋白轉(zhuǎn)移的效率不同等導(dǎo)致的“假象”。為了確保我們看到的條帶趨勢是“真像”，我們需要找到一種能夠反映蛋白質(zhì)總量的標(biāo)準(zhǔn)，也就是內(nèi)參。我們將內(nèi)參作為參照物，用目標(biāo)蛋白信號強度除以內(nèi)參信號強度，得到的結(jié)果就能更準(zhǔn)確地反映出目標(biāo)蛋白在不同樣品中的表達水平。這就是為什么我們需要使用內(nèi)參的原因。

 三、常用內(nèi)參有哪些？

 1、總蛋白或者胞質(zhì)蛋白內(nèi)參（定位于細(xì)胞質(zhì)）主要包括以下3類：

 β-actin（肌動蛋白）：β-actin廣泛存在于不同類型的細(xì)胞中，分子量約為42 kDa，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種結(jié)構(gòu)蛋白，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建和細(xì)胞的運動等功能。

 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）：GAPDH參與細(xì)胞糖酵解途徑中的反應(yīng)，分子量約為36 kDa，位于細(xì)胞質(zhì)中，廣泛存在于不同類型的細(xì)胞中。

 tubulin（微管蛋白）：tubulin是微管蛋白家族中的一員，主要參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建，包括α和β兩種亞型，α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kD和50kD,其實際檢測條帶均在55kD左右，位于細(xì)胞質(zhì)中。

2、胞核蛋白內(nèi)參（定位于細(xì)胞核）主要包括以下2類：

 Histone H3：是組蛋白家族的一員，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，分子量約15 kD。

 Lamin （包括A和B）是一種胞核內(nèi)骨架蛋白，與核膜結(jié)合，Lamin A的分子量約為74 kDa，Lamin B的分子量約為67 kDa。

 3、胞膜蛋白內(nèi)參（定位于細(xì)胞膜）：

 鈉鉀ATP酶(Na/K ATPase)：在哺乳動物中，Na/K ATPase的α亞單位分子量為約110 kDa，β亞單位分子量為約33 kDa。

 4、細(xì)胞器內(nèi)參

四、內(nèi)參蛋白的選擇策略

 1、內(nèi)參選擇的總體策略：

 首先，最重要的一條原則是，內(nèi)參在樣品中含量相對穩(wěn)定，不受實驗處理的影響，這樣才能保證不同樣本之間的比較是可靠的。

 其次，選擇與待檢測蛋白在生物學(xué)功能上無關(guān)的蛋白作為內(nèi)參。

 最后，內(nèi)參的分子量與目標(biāo)蛋白質(zhì)不同，易于區(qū)分。一般建議分子量相差5KD以上。

 2、內(nèi)參選擇的步驟：

 先通過權(quán)威的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot（https://www.uniprot.org/） 查找目的蛋白的信息，包括細(xì)胞亞定位（用以選擇提取總蛋白、膜蛋白、胞質(zhì)蛋白、核蛋白還是細(xì)胞器蛋白），分子量（區(qū)分內(nèi)參蛋白的分子量）。

 然后根據(jù)查到的信息，確定要提取的蛋白類型（總、膜、胞質(zhì)、核還是細(xì)胞器），按以下建議選擇內(nèi)參：

1）     如果我們提取的是總蛋白或者胞質(zhì)蛋白，從β-actin、GAPDH和tubulin中選擇其中1種就夠了。

2）     如果我們提取的是核蛋白（使用核蛋白抽提試劑盒），那么選擇Histone H3或Lamin兩種之一即可。

3）     如果我們提取的是膜蛋白（使用膜蛋白抽提試劑盒），那么選擇Na/K ATPase。

4）     如果是分離線粒體后提取的蛋白，可以選擇COX IV。

 需要注意的是,某些病理生理狀態(tài)下，有些管家基因的表達會受到明顯干擾。比如：

GAPDH不宜作為糖代謝紊亂和缺氧的狀態(tài)下的樣本的內(nèi)參。

Lamin不宜用來做凋亡實驗的內(nèi)參。

Tubulin不宜作為經(jīng)抗癌和抗真菌藥處理過的樣本的內(nèi)參。

Lamin B不宜作為胚胎干細(xì)胞的內(nèi)參。

PCNA不宜作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等。

對于分泌性樣本，如血漿、乳汁等，由于沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，應(yīng)選擇分泌蛋白作為內(nèi)參比如Transferrin。